細菌コアゲノムを使用した Dolosigranulum pigrum 特異的 PCR プライマーの設計と検証

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6110 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

Dolosigranulum pigrum - 鼻のマイクロバイオームの重要なメンバーとしてますます認識されている乳酸菌。 現在、D. pigrum 分離株を確認し、臨床検体中の D. pigrum を検出するための迅速かつ低コストの選択肢は限られています。 ここでは、感度と特異性の両方を備えた D. pigrum をターゲットとする新しい PCR アッセイの設計と検証について説明します。 我々は、21 個の D. pigrum 全ゲノム配列の分析を通じて同定された単一コピーのコア種遺伝子である murJ を標的とする PCR アッセイを設計しました。 このアッセイは、D. pigrum およびさまざまな細菌分離株に対して 100% の感度と 100% の特異性を達成し、鼻腔スワブを使用した場合、D. pigrum 16S rRNA 遺伝子コピーの閾値 1.0 × 104 で D. pigrum を検出し、全体で 91.1% の感度と 100% の特異性を達成しました。綿棒あたり。 このアッセイは、鼻環境におけるジェネラリストおよびスペシャリスト細菌の役割を調査するマイクロバイオーム研究者ツールキットに、信頼性が高く迅速な D. pigrum 検出ツールを追加します。

Dolosigranulum pigrum は、ヒトの鼻腔によく見られる Carnobacteriaceae1 科に属するグラム陽性の非芽胞形成細菌です 2,3。 ベータ溶血を示す小さな白いコロニーとして 1993 年に初めて報告された D. pigrum は依然としてよく理解されておらず、現在までに知られている唯一の Dolosigranulum 種です。 疫学的には、D. pigrum は鼻のマイクロバイオームの健康な状態と関連しています 3,4。 特に、D. pigrum による上気道定着は、黄色ブドウ球菌の保菌と負の関連性があります 5、6、7、8、9。 最近では、無症候性の SARS-CoV-2 感染症患者の鼻咽頭に、より重度の症状を示す患者よりも D. pigrum がより多く存在していることが判明しました 10。

将来の臨床研究およびインビトロ研究を促進するには、D. pigrum を同定するための迅速かつ費用効果の高い方法が必要です。 標準的な生化学的方法は、配列決定ベースの方法と同様に、高価で時間がかかります。 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型 (MALDI-TOF) 分析は費用対効果が高くなりますが、臨床サンプルから D. pigrum を直接検出するために使用することはできません。 コアゲノムベースのアプローチを使用して、D. pigrum 分離株を確認し、臨床サンプルから直接 D. pigrum の存在を検出するために使用できる PCR ベースのアッセイを設計および検証しました。

まず、利用可能な 21 個の D. pigrum 全ゲノム配列の遺伝的多様性を分析しました (NCBI からの n = 7、および社内の D. pigrum ゲノムからの n = 14、表 S1)。 コアゲノムの非組換え領域から 87,993 個の SNP を抽出し、最尤系統発生に基づいて遺伝的多様性を調べました (図 S1)。 これは、複数の異なる D. pigrum 系統を示し、D. pigrum の非クローン性とゲノム収集の堅牢性の両方を示しています。 次に、D. pigrum パンゲノムを生成および分析し、1291 個のコア遺伝子と 357 個のアクセサリー遺伝子を特定しました。 潜在的なアッセイターゲットとして、1291 個のコア遺伝子に焦点を当てました。

アッセイ標的遺伝子の発見は複数のステップからなるプロセスでした (図 1)。 リボソーム遺伝子 (n = 71) および他の属のホモログを持つ遺伝子 (n = 345) を除去しました。 843 個の単一コピーコア種遺伝子からランダムに選択されたアッセイ標的遺伝子の手動フィルタリングが実行され、アッセイ標的遺伝子が：（a）21 個すべての D. pigrum ゲノムに存在する必要がある、（b）70 個未満しか含まれていないことが必要） BLASTによる非ドロシ顆粒分類群からの配列に対する類似性同一性およびカバー率%、(c)Primer3設計基準を満たすフォワードおよびリバースプライマー配列を含み、BLASTによる非ドロシ顆粒分類群からの配列に対する類似性同一性およびカバー率が50%未満である。

アッセイ設計のためのコアゲノムベースのアプローチ。 アッセイターゲットのパンゲノムをマイニングするために採用されたアプローチの概略図。 パンゲノム解析ワークフローの後続の各ステップでは、目的の生物に固有のコア ゲノムを最終的に保持するために遺伝子がどのようにフィルタリングされるかを示します。