非臨床における SIV を標的とした CRISPR の前臨床安全性と生体内分布

遺伝子治療 (2023)この記事を引用

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本研究では、HIV感染の確立されたモデルである、ART処理されウイルス制御されたサル免疫不全ウイルス（SIV）感染アカゲザルにおけるプロウイルスDNAのin vivo編集におけるCRISPR-Cas9遺伝子編集技術の安全性と有用性を実証する。 EBT-001 は、SIV ゲノムの複数の領域 (ウイルス LTR、Gag 遺伝子) を標的とするように設計された SaCas9 およびデュアル ガイド RNA を送達する AAV9 ベースのベクターです。 ここに示した結果は、3 つの用量レベル (1.4 × 1012、1.4 × 1013 および 1.4 × 1014 ゲノム コピー/kg) のそれぞれで EBT-001 を 1 回 IV 接種した結果、AAV9-EBT-001 が広範かつ機能的に体内に分布することを示しています。 SIV の既知の組織リザーバー。 オフターゲット効果や異常な病理は観察されず、EBT-001 の投与後、動物は通常の体重に戻りました。 重要なことに、2つの最高用量のEBT-001を投与されたマカクザルは、抗レトロウイルス薬で治療された対照と比較してリンパ球絶対数の改善を示しました。 総合すると、これらの結果は、EBT-001のIV投与後の安全性、生体内分布、および生体内プロウイルスDNA編集を実証し、ヒトにおけるHIVの潜在的な治療アプローチとしてのCRISPRベースの遺伝子編集のさらなる開発を裏付けるものである。

非ヒト霊長類（NHP）は、HIV パンデミックの初期からレンチウイルス感染、病理生物学、病因の理解と臨床効果の予測に使用されており、最近では HIV を治療するための根絶戦略や革新的なアプローチを評価するために使用されてきました [1、2、3]。 。 ここで紹介する研究では、サル免疫不全ウイルス (SIV) に感染した抗レトロウイルス (ART) 治療を受けたインドアカゲザルを用いて、生体内分布、安全性、および統合された細胞を標的とする CRISPR/Cas9 遺伝子編集治療 (EBT-001) の能力を評価しました。 SIV は 1 回の静脈内 (IV) ボーラス注入で投与されます [4]。 EBT-001 (SIV ターゲティング ガイド RNA をコードする) は、EBT-101 (HIV ターゲティング ガイド RNA をコードする) のサルホモログであり、アデノ随伴ウイルス血清型 9 (AAV9) を封入し、ウイルスの長末端反復配列 (LTR) および Gag 遺伝子を標的とする SaCas9 エンドヌクレアーゼおよびデュアルガイド RNA (gRNA)。 EBT-101 は、目的の CRISPR 標的部位の間に位置する大きな介在組み込みプロウイルス SIV DNA 配列を除去するように設計されており、それにより 3 つの可能な欠失が生成されます: 5'LTR から Gag、Gag から 3'LTR、および 5'LTR から 3'LTR 。 AAV9送達の使用は、AAV9が安全性、有効性、および広範な生体内分布特性を示した以前の遺伝子治療臨床試験からの大量の証拠に加えて、小型および大型動物モデルでの我々の初期研究によって裏付けられています[4、5、6]。 。 ここでは、広範なオフターゲット分析、EBT-001 の複数回投与 (1012、1013、1014 GC/kg) およびインドアカゲザルにおける延長研究 (3 か月および 6 か月) の生体内分布を含む、安全性に関するより包括的なデータを紹介します。 SIVモデル。 この前臨床安全性、生体内分布、および有効性の研究では、SIV 編集のための EBT-001 の単回 IV 投与は忍容性が高く、オフターゲット効果が観察されることなく NHP のウイルス保有庫に広範囲に到達して切除できることが実証されました。 これらの結果は、HIV 遺伝子編集のための EBT-101 の 1 回の IV 接種を利用して、全身の感染組織のウイルス保有者に到達し、潜在型 HIV プロウイルス DNA を安全かつ特異的に in vivo 編集できることを裏付けています。

この研究は、BIOQUAL の IACUC、プロトコル番号 18-036 によって承認されました。 12 頭の雄のインドアカゲザル (Macaca mulatta) がプエルトリコのカリブ海霊長類研究センターから入手されました。 2 つの研究が実施されました。 1つ目は、n = 10の動物で、統計学者によって4つの治療グループにランダムに分けられ、そのうち3頭は未治療、3​​頭は1.4×1012 GC/kg EBT-001で治療、4頭は1.4×1013 GC/kg EBT-001で治療された（2頭は剖検） EBT-001 後 3 か月後と 6 か月後に 2 回)。 ランダム化は、社会的パートナーのペアの動物が同じグループ内であるという制限付きで、置換ブロックランダム化法を使用して行われました。 2 番目の研究は、n = 2 で、1 log 高い 1.4 × 1014 GC/kg の EBT-001 用量を使用し、ここではランダム化は行われませんでした。 すべての動物をスクリーニングしたところ、Mamu-A*01、Mamu-B*08、および Mamu-B*17 についてトリプルネガティブでした。 すべてのアカゲザルは、メリーランド州ロックビルにある BIOQUAL の Piccard Drive Facility で受け取られ、ここで説明されているすべての in vivo 研究がそこで行われました。 アカゲザルは、研究前にレトロウイルス (STLV および SIV)、SA8 ウイルス、SHF ウイルス、および麻疹ウイルスについて血清学的事前スクリーニングを受けました。 動物を SIVmac239 (チューレーン霊長類センターのプレストン マルクス博士からの寄贈) に感染させました。 動物は、テノホビル (TDF; #T018500; 15 mg/kg/動物)、エムトリシタビン (FTC; #E525000; 50 mg/kg/動物)、およびドルテグラビル (DTG; #D528800; 2.5 mg/動物) の毎日の ART レジメンを開始しました。 kg/動物) (Toronto Research Chemicals) 感染後 28 日目から開始し、剖検を続けた。 動物の罹患率、死亡率、傷害、食物と水の入手可能性を観察した。 健康状態の悪い動物は、さらなるモニタリング、臨床治療、および安楽死の可能性のために特定されました。 観察には、皮膚、毛皮、目、耳、鼻、口腔、胸部、腹部、外性器、手足、足、呼吸器および循環への影響、唾液分泌などの自律神経への影響、神経系への影響の評価が含まれますが、これらに限定されません。震え、けいれん、取り扱いに対する反応性、神経学的/行動的影響、異常な行動が含まれます。 SIV ウイルス量 (検出限界 50 コピー/mL) は、感染の過程でエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 血漿中で測定されました (補足資料および方法)。 全血は研究期間中の複数日に採取され、全血球計算 (CBC) 分析および血液化学検査のために IDEXX BioAnalytics, Inc. に提出されました。 SIV 感染後 6 か月目に、1 mL/分の速度でゆっくりとした IV 注入により動物に EBT-001 を投与しました。 投与される EBT-001 ベクターの量は、現在の体重と用量に基づいて、各動物の合計 100 mL の 1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に追加されました (表 S2)。 EBT-001注入後3か月または6か月のいずれかで、動物は完全な剖検を受けました（補足資料および方法）。 BioQual では、動物のグループ分けに対する盲検化は行われませんでした。