メタノール固定は液滴に最適な方法です

Communications Biology volume 6、記事番号: 522 (2023) この記事を引用

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この記事に対する出版社の訂正は 2023 年 6 月 13 日に公開されました

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単一細胞トランスクリプトミクスにおける主な重要なステップは、サンプルの調製です。 サンプル処理をライブラリー調製から分離するために、解離後に細胞を保存するためのいくつかの方法が開発されています。 ただし、これらの方法の適合性は、処理する細胞の種類によって異なります。 このプロジェクトでは、人工多能性幹細胞由来の神経細胞およびグリア細胞に対する液滴ベースの単一細胞 RNA-seq の保存方法の体系的な比較を実行します。 私たちの結果は、DMSO が細胞ごとに検出される RNA 分子および遺伝子の点で最高の細胞品質を提供する一方で、細胞組成に強い影響を与え、ストレスおよびアポトーシス遺伝子の発現を誘導することを示しています。 対照的に、メタノール固定サンプルは、新鮮なサンプルと同様の細胞組成を示し、良好な細胞品質とわずかな発現バイアスを提供します。 まとめると、我々の結果は、メタノール固定が神経細胞集団に対する液滴ベースの単一細胞トランスクリプトミクス実験を実行するための最適な方法であることを示しています。

単一細胞トランスクリプトミクス (scRNA-seq) 法は、個人、組織、さらには疾患における遺伝子発現をハイスループットで研究する方法に革命をもたらしました 1、2、3。 以前は、研究はバルク、つまり特定のサンプルを構成する細胞集団における遺伝子の発現レベルの変化を特定することに限定されていました。 したがって、これらのアプローチでは、対象サンプルの細胞組成の変化と個々の細胞内の遺伝子発現の変化という 2 つの異なる効果が混合されました。 現在、scRNA-seq により、これら 2 つの効果を独立して評価することができ、細胞組成の変化 4,5 と特定の細胞型における遺伝子の発現 6,7 の両方を検出できます。

scRNA-seq 法の人気にもかかわらず、未解決の技術的課題がまだいくつかあります。 たとえば、scRNA-seq に必要な組織からの細胞の解離と良好な細胞懸濁液の取得は非常に組織特異的であり、酵素消化、機械的分離、蛍光活性化細胞などのさまざまな戦略の使用が必要になる場合があります。仕分けおよびその他の技術8、9、10、11、12。 その結果、scRNA-seq 用のサンプルの調製には数時間かかる場合があり、後の時点でサンプルを処理する方が便利になります。 技術的な問題とは別に、外部施設へのサンプルの輸送などの他の理由でサンプルの解離と処理を切り離す必要がある場合、または複数のサンプルを収集して後の時点で一緒に処理したい場合にも、細胞の保存は重要です。時間やお金を節約するため。 これらすべての場合において、研究者は、元のサンプルと比較した個々の細胞の細胞組成および遺伝子発現の違いを最小限に抑える方法でこれらのサンプルを保存したいと考えています。 つまり、最良の保存方法は、サンプルの細胞組成および個々の細胞のトランスクリプトーム プロファイルへの影響が最も少ない方法です。

この問題を克服し、サンプルの取り扱いをライブラリーの調製から切り離すために、いくつかの細胞保存方法がすでに開発されています。 その中には、メタノール固定 13,14、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート 15、ジメチルスルホキシド (DMSO) 凍結保存 16,17、酢酸メタノール (ACME)10、パラホルムアルデヒド 18、CellCover17、および vivoPHIX19 など、自家製および市販のソリューションの両方が含まれています。 これらの方法は、サンプル組成と細胞の RNA の品質を維持することを目的としています。 しかし、サンプルの調製が組織固有であることを考慮すると、サンプルごとに異なる保存方法が最適になる可能性があると予想されます。 これらのプロトコールの多くは、細胞株または末梢血細胞などの入手が容易な細胞でのみテストされているため、解離が難しい細胞や解離中に損傷を受ける可能性のある細胞でのパフォーマンスがどのように機能するかは明らかではありません。 特に、これまでの方法はいずれも、神経疾患を引き起こす分子機構を研究するための神経細胞の主な供給源である成熟ニューロンやヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）由来ニューロンではテストされていません。